Antistof mod og dets anvendelse til forbedring af ELISA til viljestyrke

pfizeracademy

Prokaryot ekspression af mus Stra8 og fremstilling og identifikation af kanin-anti-mus Stra8 polyklonalt antistof

 

Mål At prokaryotisk kategorisk mus stimuleret af retinsyre-gen 8 (Stra8) og sammensat kanin-anti-mus Stra8 polyklonalt antistof. Strategier Det rekombinante plasmid pET28a-Stra8 blev konstrueret ved kloningskompetence og genkendt ved dobbelt enzymfordøjelse og sekventering, hvorefter det blev omarbejdet til E. coli BL21 (DE3). Ekspressionen af ​​Stra8 rekombinant protein blev induceret af IPTG.

Det prokaryote protein blev oprenset ved His-TAG-affinitetskromatograf, hvorefter det blev brugt til at immunisere newzealandske hvide kaniner til at erhverve Stra8 polyklonalt antistof. ELISA-, Western blot- og immunfluorescensassays var blevet anvendt til at finde ud af henholdsvis antistoftiter, validitet og specificitet.

Resultater Det rekombinante plasmid pET28a-Stra8 blev konstrueret effektivt som dobbelt enzymfordøjelse og sekventering bekræftet, og det prokaryote protein blev udtrykt og oprenset med succes. Titlen på det polyklonale antistof nåede 1: 106. Western blotting bekræftede, at det polyklonale antistof især kunne anerkende nativt Stra8-protein i testiklerne.

Immunfluorescensassay afslørede, at det polyklonale antistof havde god reaktivitet og vil anerkende Stra8-protein i mus testikler. Konklusion Stra8 prokaryotisk protein vil med succes blive induceret i E. coli, og især kanin-anti-Stra8 polyklonalt antistof har været klar.

 

pfizeracademy

pfizeracademy

Fremstilling af et ekstremt specielt polyklonalt antistof mod og dets anvendelse til forbedring af ELISA til viljestyrke i plasma

Til terapeutisk overvågning og farmakokinetisk undersøgelse af det potente hypocholesterolæmiske middel fluvastatin (FLV) var det nødvendigt med et valgt antistof til tilfælde af en delikat enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) for den korrekte viljestyrke af FLV i plasma. Ved denne undersøgelse har et ekstremt specielt polyklonalt antistof mod FLV været klar.

FLV blev koblet til keyhole limpet hemocyanin (KLH) og bovint serumalbumin (BSA) under anvendelse af carbodiimidreagens. FLV-KLH-konjugat blev anvendt som et immunogen. Feminine 8-ugers forældede hvide kaniner fra New Zealand var blevet immuniseret med en emulsion af FLV-KLH med Freunds adjuvans. Kaninernes immunrespons blev overvåget ved direkte ELISA under anvendelse af FLV-BSA immobiliseret på mikrobrøndsplader som en stabil sektion.

Kaninen, der bekræftede den allerbedste antistoftiter og affinitet til FLV, blev arret, og dens sera var blevet opsamlet. IgG-fraktionen blev fjernet og oprenset ved affinitetskromatografi på en protein A-søjle. Specificiteten af ​​det oprensede antistof for FLV blev evalueret ved skrå aggressiv ELISA under anvendelse af adskillige rivaler fra FLV-strukturelle analoger og terapeutiske mæglere anvendt med FLV i et blandingsmiddel. Antistoffets overdrevne affinitet (IC50 = 150 pg ml-1) aktiverede FLV’s viljestyrke i plasma i koncentrationer så lidt som 20 pg ml-1.

Et polyklonalt antistof mod et rekombinant udtrykt Triticum aestivum RHT-D1A-protein

Baggrund: Dværgende alleler med nedsat højde-1 har en effekt på DELLA-proteiner, der tilhører en husstand af formodede transkriptionsregulatorer, der modulerer plantens fremskridt og forbedring. Arabidopsis thaliana-genomet koder for 5 DELLA-proteiner, hvorimod monocot-vegetation, der minder om ris, byg og hvede, hver har et enkelt DELLA-protein. I hvede koder vildtype Rht-B1a- og Rht-D1a-gener DELLA-proteiner og har mange alleler, der inkluderer læsioner.

Blandt dem er Rht-B1b og Rht-D1b de mest typiske mutante dværgende alleler, som har udført en nøglehalvdel inden for skabelsen af ​​højtydende hvedesorter. Uanset deres grundlæggende roller i plantebiologi er DELLA-proteiner i hvede indtil nu primært blevet undersøgt i forbindelse med den fænotypiske indvirkning af defekte Rht-mutanter på udbytterelaterede egenskaber uden forskning i de underliggende mekanismer.

RHT-1-proteinet skal dog kun påvises i hvedevæv på grund af fravær af acceptable molekylære instrumenter til karakterisering af RHT-udførelse og proteininteraktioner i tegntransduktion. Denne undersøgelse er målrettet mod fremstilling af et polyklonalt antistof mod hvede RHT-D1A-proteinet.

Resultater: For at generere anti-RHT-D1A-antistoffet udtrykte vi og rensede opløselig 6xHis-mærket RHT-D1A. Den oprensede rekombinante RHT-D1A blev injiceret i newzealandske hvide kaniner til dannelse af polyklonalt antiserum. Det polyklonale anti-RHT-D1A-antistof blev oprenset ved ammoniumsulfatudfældning, vedtaget ved affinitetskromatografi på protein A-agarosekugler.

Det oprensede polyklonale antistof blev påvist at være effektivt til immunblotting, western blot-hybridisering og immunudfældning. I hvedeplanteekstrakter anerkendte det polyklonale antistof et protein med en molekylvægt nær den forventede molekylvægt af det endogene RHT-D1A-protein. Vi demonstrerede desuden, at RHT-D1A forsvandt som reaktion på eksogen og endogen gibberellinsyre.

Konklusion: Det oprensede polyklonale antistof rejst mod det rekombinante RHT-D1A-protein er tilstrækkeligt specifikt og delikat og kan være en nyttig gizmo til fremtidig indsigt i opstrøms og nedstrøms elementer af DELLA-regulerende mekanismer i hvedevegetation.

Ekspression, oprensning og polyklonalt antistofpræparat af Schistosoma japonicum SjGrpE-proteinet

Mål: At analysere de organiske egenskaber ved Schistosoma japonicum SjGrpE-protein og at specificere og rense det rekombinante SjGrpE-protein og se på dets immunogenicitet.

Strategier: Aminosyresammensætningen, molekylvægt, hydrofilicitet og hydrofobicitet, transmembranareal, tegnpeptid, lokalisering, phosphoryleringswebsted, ubiquitineringswebsted, glykosyleringswebsted, sekundære og tertiære konstruktioner og B-celleepitoper af SjGrpE-proteinet var blevet forudsagt ved anvendelse bioinformatik analyser.

SjGrpE-genet blev amplificeret ved anvendelse af PCR-assay under anvendelse af S. japonicum cDNA som en skabelon, fordøjet dobbelt enzym og bundet til pET28a-vektoren til opnåelse af det rekombinante plasmid pET28a-SjGrpE. Det rekombinante plasmid pET28a-SjGrpE blev omarbejdet til Escherichia coli BL21, hvorefter IPTG blev anvendt til at inducere ekspressionen af ​​målproteinet, som blev oprenset ved nikkelionaffinitetskromatografi.

Efter at mus var blevet immuniseret med det rekombinante SjGrpE-protein, var musesera blevet opsamlet, og det polyklonale antistof mod SjGrpE-proteinet blev karakteriseret.

Resultater: SjGrpE-protein, som blev anerkendt som et hydrofilt protein, blev forudsagt at have en molekylvægt på ca. 24. tre kDa uden transmembrane områder eller tegnpeptider og finde inden i mitokondrionen. SjGrpE-protein indeholdt 18 fosforyleringswebsteder og et par ubiquitineringswebsteder havde dog ingen glycosyleringswebsteder. Samt SjGrpE-protein indeholdt 5 B-celleepitoper.

Den komplette størrelse af SjGrpE-genet var ca. 660 bp. Det rekombinante pET28a-SjGrpE-plasmid blev effektivt genereret, og det rekombinante SjGrpE-protein blev opnået efter affinitetskromatografi, som stimulerede mus til at udskille højtiter-antistoffer.

Konklusioner: Det rekombinante SjGrpE-protein har været effektivt klar, og dette rekombinante protein har en overdreven immunogenicitet, hvilket giver et grundlag for at vurdere dets værdi som en vaccinkandidat til S. japonicum-infektioner.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *