Ekspressionen og oprensningen af LpxA af Chlamydia trachomatis og fremstilling af dets polyklonale antistof
Formålet med denne undersøgelse er at rense LpxA-proteinet fra Chlamydia trachomatis (Ct) og sammensætte det polyklonale antistof i modsætning til LpxA-protein for at lægge et grundlag for at lære funktionen af LpxA-protein. LpxA-genet blev amplificeret ved PCR. Ekspressionsplasmidet pET28a-LpxA blev konstrueret ved anvendelse af pET28a, fordi vektoren. Fusionsproteinet indeholdende 6 histidinmærke blev induceret af IPTG og oprenset ved Ni2 + kromatografi gel.
Det oprensede His-LpxA-protein blev brugt som et immunogen til at immunisere newzealandske kaniner subkutant ved hjælp af det igen til at organisere polyklonalt antistof. Immunoblotting blev anvendt til at detektere responset mellem antistoffet og His-LpxA. Engagementet af polyklonalt antistof-titer blev påvist ved ELISA. Den relative molekylvægt af His-LpxA var 32. otte kDa, og det kan meget vel udtrykkes i Escherichia coli.
Renheden af det oprensede protein var ca. 95%. Efter immunisering af newzealandske kaniner var antiserumet i stand til at anerkende det rekombinante His-LpxA-protein med en titer bedre end 1: 10240. Ved denne undersøgelse blev LpxA-protein effektivt oprenset, og antiserum var klar, hvilket tilbød et eksperimentelt fundament til at lære at betjene LpxA-protein.
Effektivitetsanalyse af det polyklonale anti-rabiesvirus ribonukleoprotein IgG-antistoffer produceret internt til brug ved direkte fluorescerende antistofkontrol
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærkede anti-rabiesvirus ribonukleoprotein (RNP) antistoffer kan anvendes som immunreagenser i direkte fluorescerende antistof-test (dFAT) til rabiesdiagnoser. Mens interne varer ofte bruges af laboratorier, er de fleste konjugater industrielle reagenser. Forretnings-anti-RNP-antistoffer er ikke desto mindre ude til analysefunktioner i Brasilien, ikke desto mindre, hvilket bidrager til den voksende brug af interne producerede antistoffer.
Overvejer, at konjugat af høj kvalitet kan påvirke resultaterne opnået gennem rabiesanalyse, forsøgte vi at undersøge effektivitetsbehovene for internt produceret polyklonalt anti-RNP IgG-FITC til software i dFAT. Til det mål er deres reproducerbarhed, diagnostiske følsomhed og specificitet blevet evalueret. Titeren af polyklonalt anti-RNP IgG-FITC blev oprindeligt bestemt og evalueret af dFAT under anvendelse af prøver fra centralnervesystemet (CNS) fra forskellige dyrearter (hunde, katte, kvæg, heste, flagermus og ikke-humane primater).
Som vores vigtigste konsekvens nåede det polyklonale anti-RNP IgG-FITC en titer på 1: 30/1: 40 i dFAT med 100% diagnostisk følsomhed og specificitet. Som reproducerbarhed introducerede antistofferne, uanset fremstillingsbatch, de samme præstationer. Som konklusion viste det sig, at den egenproducerede polyklonale anti-RNP IgG-FITC var passende til påvisning af rabiesvirusantigen ved hjælp af dFAT.
Fremstilling af F (ab ‘) 2 fra monoklonale og polyklonale antistoffer
Antistoffer anvendes bredt i terapeutiske, diagnostiske og analysefunktioner, og antistofderivater ækvivalente med F (ab ‘) 2-fragmenter anvendes, når der kun kræves et specifikt antistofområde. F (ab ‘) 2 vil blive produceret ved hjælp af antistofteknik, men nogle funktioner kræver F (ab’) 2 produceret fra et unikt formuleret antistof eller straks fra en polyklonal antistofpulje.
Cysteinprotease-immunglobulin-nedbrydende enzym (IdeS) fra Streptococcus pyogenes fordøjer immunoglobulin G (IgG) især og effektivt for at tilvejebringe F (ab ‘) 2. Lige her elementerer vi fremstillingen og oprensningen af rekombinant IdeS; dets anvendelse til at fordøje monoklonale eller polyklonale antistoffer mod F (ab ‘) 2-fragmenter; og F (ab ‘) 2-oprensning ved hjælp af på hinanden følgende affinitetskromatografitrin.
Den resulterende F (ab ‘) 2 udviser overdreven renhed, bevarer antigenbindende ydeevne og kan let anvendes i forskellige downstream-funktioner. © 2020 af John Wiley & Sons, Inc. Primær protokol: Fremstilling og oprensning af F (ab ‘) 2-fragmenter fra monoklonale og polyklonale antistoffer ved anvendelse af IdeS Alternativ protokol: Oprensning af polyklonale antigenspecifikke F (ab’) 2-fragmenter fra humant serum eller sekreter Assist Protocol: Fremstilling og oprensning af IdeS.