Bakteriel ekspression af 183-227aa område af HER3 ekstracellulært område I og fremstilling og identifikation af dets polyklonale antistoffer
Mål: At organisere det rekombinante peptid MVF-HER3 I sammensat af 183-227aa peptidfasen af human epidermal progress issue receptor 3 (HER3 I) og mæslingsvirusproteinet 288-302 peptidfase (MVF) og sammensætte polyklonale antistoffer ( PcAb) mod dette rekombinante peptid.
Strategier: MVF-HER3 I genet blev syntetiseret kemisk og subklonet i pET21b eller pET32a plasmid indeholdende Thioredoxin (Trx) taggen. De rekombinante plasmider er blevet genkendt ved endonukleasefordøjelse. MVF-HER3 I blev tidligere udtrykt i E. coli BL21 (DE3) celler under en optimal bakteriel ekspressionssituation.
Fusionsproteinet Trx-MVF-HER3 I blev oprenset ved anvendelse af nikkelionaffinitetskromatografi, og det oprensede protein blev fordøjet ved enterokinase for at fjerne Trx-mærket. Den fordøjede kombination gennemgik yderligere nikkelionaffinitetskromatografi for at erhverve oprenset MVF-HER3 I. Den oprensede MVF-HER3 I blev brugt til at immunisere SD-rotter subkutant til fremstilling af klar anti-MVF-HER3 I PcAb.
Titeren af PcAb blev besluttet under anvendelse af ELISA. Bindingerne af anti-MVF-HER3 I PcAb til MVF-HER3 I, native HER3- og MCF7-celler er blevet analyseret under anvendelse af immunblotting, immunudfældning og laserkonfokal mikroskopi. Ekspansionens inhiberingspåvirkning af antistofferne på MCF7-celler dyrket i fravær eller tilstedeværelse af NRG blev vurderet ved anvendelse af sulforhodamin B.
Resultater: Det rekombinante peptidgen kunne ikke udtrykkes alene, men kunne effektivt udtrykkes efter fusion med Trx-gen under optimerede omstændigheder. Fusionspeptidet MVF-HER3 I plejede at være effektivt klar fra Trx-MVF-HER3 I.
Anti-MVF-HER3 I PcAb, med en titer, der når 1: 512 000, især sikker på MVF-HER3 I, anerkendte nativ HER3 og sikker på membranen af MCF7-celler. Det opnåede PcAb kan dosisafhængigt hæmme ekspansionen af MCF7-celler uanset tilstedeværelse eller fravær af NRG.
Konklusioner: Vi opnåede effektivt det rekombinante peptid MVF-HER3 I og klarede dets PcAb, hvilket kan lette yderligere målrettet evaluering af HER3-signalvejen.
In utero publicitet til endogent polyklonalt maternelt anti-Caspr2-antistof resulterer i adfærdsmæssige abnormiteter, der ligner autismespektrumdysfunktion hos hanmus
Tanken om, at reklame i livmoderen til moderens anti-hjerne-antistoffer bidrager til hændelsen af autismespektrumproblemer (ASD) er blevet underholdt i over et årti. Vi besluttede, at antistoffer, der fokuserer på Caspr2, er aktuelle med overdreven hyppighed hos mødre med hjerne-reaktiv serologi og en baby med ASD, og yderligere viste, at reklame i utero til et monoklonalt anti-Caspr2-antistof, afledt af en mor til en ASD-baby, led til en ASD-lignende fænotype hos mandlige afkom.
Nu foreslår vi en helt ny mannequin til at gennemgå resultaterne af in utero reklame for anti-Caspr2 antistof. Dæmninger immuniseret med den ekstracellulære del af Caspr2-specifikke anti-Caspr2-antistoffer gennem graviditet for at hæve efterligner den menneskelige situation.
Mandlige dog ikke feminine mus født til dæmninger, der huser polyklonale anti-Caspr2-antistoffer, bekræftede uregelmæssig kortikal vækst, nedsat dendritisk kompleksitet af excitatoriske neuroner og reduceret antal hæmmende neuroner inden for hippocampus, ud over gentagen adfærd og svækkelse af nyheds nysgerrighed inden for den sociale lystkontrol som voksne.
Disse oplysninger, der understøtter patogeniciteten af anti-Caspr2-antistoffer, er i tråd med ideen om, at anti-hjerne-antistoffer, der er aktuelle hos piger under graviditet, kan ændre fostrets sindsvækst og sikre, at mænd er særligt tilbøjelige.
pfizeracademy
In-silico karakterisering og RNA-bindende protein primært baserede polyklonale antistoffer, der fremstiller til påvisning af citrus tristeza-virus
Citrus tristeza-virus (CTV) er det etiologiske middel til den skadelige Tristeza-sygdom, en stor hindring for den sunde citrushandel over hele verden. Rutinemæssig indeksering af CTV er en integreret del af sygdomsundersøgelser og citrus budwood certificering til fremstilling af sygdomsfrie plantningsmaterialer. Derefter blev den aktuelle forskning udført for at udvikle et miljøvenligt serologisk assay til CTV-detektion primært baseret på RNA-bindingsproteinet (CTV-p23), der oversættes fra et subgenomisk RNA (sgRNA), der akkumuleres i øgede intervaller i CTV-inficeret afgrøder.
CTV-p23-genet blev amplificeret, klonet og polyklonale antistoffer er blevet rejst mod rekombinant CTV-p23-protein. Effektiviteten af de producerede polyklonale antistoffer blev undersøgt af Western blots og ELISA for at udvikle et hurtigt, delikat og økonomisk billigt CTV-detektionsinstrument og blev brugt til indeksering af et stort udvalg af planteprøver.
De hævede polyklonale antistoffer påviste især CTV og gav konstante resultater for CTV-positive og skadelige prøver diskrimination i sammenligning med typisk RT-PCR. Det
Preparation of PrP-specific Polyclonal Antibody through Immunization of PRNP-knockout Mice with Recombinant Human PrP Protein
Fremstilling af PrP-specifikt polyklonalt antistof gennem immunisering af PRNP-knockout-mus med rekombinant humant PrP-protein
Mål: Den særlige prognose for prionlidelser hos mennesker og dyr afhænger af undersøgelsen af bestemte patologiske ændringer og / eller påvisning af PrP Sc i sindsvæv under mistænkte omstændigheder. Således er voksende strategier for at erhverve PrP-antistof med god specificitet og følsomhed nøglen til identifikation af prion.
Strategier: Vi klargør et PrP-specifikt polyklonalt antistof (pAb P54) i en PRNP-knockout-musemannequin gennem immunisering med rekombinant humant PrP-proteinrester i fuld længde 23-231. Derefter verificerede vi, at pAb i Western blot, immunhistokemi (IHC) og immunfluorescerende (IFA) assays.
Resultater: Western blot illustreret, at det nyligt klargjorte pAb P54 kan reagere med rekombinant PrP-protein, regelmæssig sind PrP C fra sunde gnavere og mennesker og patologisk PrP Sc i hjernen hos eksperimentelle gnavere, der er kontamineret med scrapie, og mennesker, der er kontamineret med flere typer prionlidelser .
De elektroforetiske tankemønstre PrP C og PrP Sc, der blev bemærket efter deres respons med pAb P54, har været næsten identiske med disse produceret af forretnings-PrP monoklonale antistoffer. Tre glycosylerede PrP-molekyler i sindshomogenaterne er blevet tydeligt demonstreret inden for reaktionerne af disse molekyler med pAb P54.
IHC-analysen afslørede åbenlyse PrP-aflejringer i de GdnCl-behandlede sindskiver af 139A-inficerede mus og 263Ok-inficerede hamstere. IFA-undersøgelser med pAb P54 bekræftede desuden klare uerfarne alarmer omkring blåfarvede cellekerner.
Konklusion: Den nyligt klargjorte pAb P54 udviste pålidelig specificitet og følsomhed og kan således have potentielle formål ikke kun inden for forskning i prionbiologi, men desuden inden for prognosen for humane og eksperimentelle prionlidelser fra gnavere.